1915年5月4日，日本为迫使中国接受“二十一条”，召开内阁会议及元老大臣会议，决定对华发出最后通牒。5月7日，日使日置益发出最后通牒，宣称除第5号各项允许以后再行协商外，限48小时完全应允，否则“将执认为必要之手段”。与此同时，日本政府颁布关东戒严令，命令山东和奉天日军备战。日商纷纷回国，日舰队游弋于渤海，进行武力威胁。
各国对日本对华举措迅速作出反应。俄、法两国虽然猜忌日本，却因欧战无暇顾及。5月7日晚，袁政府外交部派员前往俄国使馆寻求支持，俄使克鲁朋斯基要中国政府“立即无条件地接受日本的最后通牒”。
8日上午，英公使钟邴典到外交部访陆徵祥，说：“目前中国情形至为危险，各国不暇东顾，为目前计，只有忍辱负重，接受要求”，“不宜作武力之争”，并要陆转告袁世凯。
8日下午，袁在总统府召集会议。先由陆徵祥报告上午会见钟邴典的情况，然后讨论。发言者大都认为只有接受日本要求一途，惟独段祺瑞主张动员军队，对日示以强硬。袁说：“我国国力未充，目前尚难以兵戎相见”，权衡利害，不能不接受日本通牒。他引用古训说：“无敌国外患者国恒亡。经此大难以后，大家务必认此次接受日本要求为奇耻大辱，本卧薪尝胆之精神，做奋发有为之事业，举凡军事政治外交财政力求刷新，预定计划，定年限，下决心，群策群力，期达目的。”袁世凯一副悲愤陈词的姿态，与会者则或怨愤填胸，或神气惨沮。
5月9日，陆徵祥，曹汝霖奉命前往日本使馆递交复文，对日本4月26日提出之修正案，除第五号中各项容日后协商外，“即行允诺”，最后表示：“以冀中日所有悬案就此解决，俾两国亲善益加巩固。”
日本独占中国的野心和行径，引起美国朝野的反感。驻华美国公使芮恩施试图为中日谈判进行斡旋，但美国政府怕召致日本反对，加以又得不到英、法，俄三国的支持，所以13日声明：“凡关于损害美国之条约权利及旅华美国人民权利”，美国政府“决不承认”。
5月25日，中日双方在北京签定“中日条约”和“换文”，日方代表日置益，袁政府代表为陆徵祥。两个条约是关于山东和南满洲及东蒙古的，换文13件，内容是关于福建、汉冶萍及旅大租借期延长等问题。除第五号外，原“二十一条”的内容大都包括在内。